【目次】
CTCsとは？/ CTCsが注目される２つの背景/ CTCs診断の標準法/ 今日的課題－診断的側面/ CTCs検出法の種類/ 分析技術的課題/ 米国におけるIVDとLDTの動向/ まとめ【CTCsとは？】
がん組織から脱離して、血流に乗って全身を循環するがん細胞をCTCs（Circulating Tumor Cells）と呼称する。更に、それをバイオマーカーとしてより正確な診断や予後管理を行う技術も含まれる。
【CTCsが注目される２つの背景】
1：Liquid Biopsy
確定した診断結果に基づいて適切な治療法が患者に適用される。それでは「診断結果」とは何が一般的かといえば、疾患の予後の重要性が考慮される場合には組織生検が最も確実であるのが現状である。しかし、組織生検は侵襲性が高い上に、重篤な合併症を発症する可能性もある。（例えば慢性腎不全において人工透析適用の可否を決定する確定診断は、腎生検であることが2013ガイドラインで明記されているが、その実施率は5．3％に過ぎない。）オンコロジー領域でも、生検が難しい卵巣がん、前立腺がん、腎がん、肺がん、すい臓がん等においても同様の問題を抱えている。組織生検を血液検査で代替えする利便性の追求であり、「Liquid Biopsy」と表現される事もある。
近年では、組織生検につきまとうサンプルバイアスを克服する新しい手段として注目されている。例えば、2012年日本胃癌学会総会における熊本大学院生命科学研究部のDr.岩崎氏等が、胃癌組織生検ではHER2抗原が陰性であったが血中CTCsが顕著に上昇していた症例を報告。1年6ヶ月後に患者が死亡後、解剖した結果、胃癌粘膜面ではHER2陽性細胞は認められなかったが、腫瘍深層部には陽性細胞が確認されており、この組織が脱離しCTCsとして検知されたものと考えられる。
2：血行性転移のモニター
がん化学療法は転移の有無によって、その適用の可否が判断される場合が多い。よってその診断は予後に大きく影響し、米国では予後管理や化学療法の治療奏効を予測する臨床検査として承認されている。但し現時点では、CTCsが血行性転移のバイオマーカーであるのか、或いは転移そのものの病因であるのかは確定されてはいない。
【CTCs診断の標準法】
米国FDAが認可しているCTCs診断法は、Janssen社が提供するCell Search®という製品であり、その方法は下記のようになる。
1．血液を7.5mL採取し特殊なTubeに入れる。これは運搬を考慮し室温で96時間保管できるようになっている。遠心分離により固形成分と血漿成分に分ける。
2．上皮細胞の接着因子を標的とする抗体を表面に固定したナノビーズ強磁性流体によって分離。
3．サイトケラチン・モノクローナル抗体によって上皮細胞特異的染色を行う。
4．コンタミとなる白血球を除くためCD45を標的とする染色を行う。
5．DAP1というDNA染色により、CTCsと白血球の分別を行う。
6．磁性分離を行ない、「サイトケラチン染色且つDAP1染色」された細胞をCTCsとする。
適用されるのは、乳がん、前立腺がん、大腸がんであり、7.5mLの血液中にCTCsがそれぞれ0~4個、0~4個、0~2個以下の場合は経過観察、それ以上の場合は転移を疑い適切な治療を施す事となっている。
【今日的課題－診断的側面】
標準的成人の全血液量は約7Lであり、CTCsテストが7.5mLのサンプリングで行うのであれば、上記の標準法では全身を巡るCTCsが数千個であっても「経過観察」という事になるが、数千個のCTCsが多いのか少ないのかは、まだ確定されていない。
一方で、デュッセルドルフ大学医学部のDr.Krawczyk N等がBiomed Res Int誌2014年5月のレビューで指摘するのは、血行転移を見る上皮細胞抗原は血中でダウンレギュレートされ、従来の上皮細胞マーカーの検出では見逃し易い事である。CTCsはステムセル様のフェノタイプを発現し、薬物耐性がんや転移能の獲得に関与しているとも考えられ、近年急速に注目されて多くの研究者が注目している。
【CTCs検出法の種類】
Cell Search® 以外に研究されているCTCs検出法は、
1．Adna Test ： EpCAM、MUC1を標的 PCR法
2．CTC-Chip ： EpCAMを標的 抗体法
3．Ficoll ： EpCAM＋サイトケラチンを標的 抗体法
4．Filtration ： CK8、18、19とCD45を標的 限外濾過法
5．フローサイトメトリー： EpCAM、ALDH1を標的 抗体法
などがある。
【分析技術的課題】
7.5mLの血液中には約2,500万個の細胞が存在する。この中に1－2個存在する細胞を評価するとすれば、数を数えるだけではなく、確実な診断を行なうためには様々な解析をCTCsに適用できるのが理想である。そのためにはCTCsを生きたまま濃縮しフローサイトメーター＋セルソーターによって採取し、FISHやPCRへとつないでいく事が行われている。但し、そのためには前処理によって200~300μLまで濃縮が必要であり煩雑性は否めない。
そこで検出感度の向上により新たな展開が考えられるが、例えばDr. Lidia Sanbucetti等は2014年のWorld CTC CongressにおいてFiber Optics Arrayを用いたScan法で2500万個に1個のCTCを検出する方法を発表した。小細胞肺がんの転移モニターに適用し、CTCsの検出効率を30~50％向上させた。この方法はArray上に簡便な処理をした血液を塗布し1分のスキャンで読み取るもので、見つかったCTCsには次いでFISH、PCR、SNPなどの個別化を促進する試験の適用が可能である。現在City of Hopeがんセンターとスタンフォード大学医学部にて臨床試験が行われている。
【米国におけるIVDとLDTの動向】
日本の薬事法と同様に米国では、インビトロ診断法（IVD）はFDAがFFDLA（連邦食品・医薬品・化粧品法）によって認可を行なっている。しかし近年ではコンパニオン診断や治療を視野に入れた診断・医療分野で、LDT（Laboratory Developed Test）の急速な発達がIVDの薬事要件整備のスピードを遥かに凌駕し、独自の適用が模索されている。
IVDの定義は「ヒトサンプルを分析する方法であり、市販のテスト用デバイス・機器を含む」である。一方LDTは、FDA 75FR（2010年6月17日）によって「1施設において使用されるビトロ診断デバイスであり、登録・指定企業によって製造され品証を受けているもの」と定義される。これは例えば、新たな感染症や病源が異なる公知の感染症のような変化の早い症状や疾患の診断に使用するもの、或いはゲノミクスやオンコロジー分野等の応用研究に用いられるものである。市販品ではないのでFFDCAの規制にはマッチしないという考え方があり、ACLA（米国李承検査所協会）は2013年6月4日にFDAに対し、LDTを規制対象にしないように陳情書を提出している。LTDをどのように規制するのかはFDAも明確な見解を表明しておらず、FDAのコミッショナーMargaret Hamburg氏は2013年6月の講演で「Risk Based Framework」というポリシーを適用する方向であると説明している。
【まとめ】
CTCsはオンコロジー分野において、プライマリー治療の正確な診断方策を決定する「Liquid Biopsy」として、そのあとの予後モニタリングにおいては性格が変化していく腫瘍のキャラクタライズ、特に薬剤耐性化と血行転移能を迅速に追跡するために大変有用な手段となっている。
但し、抗原特異的な検出法が疾患の種類や血中における分解などで感度・特異度共に劣化していく事、7.5mLに標準化されてる採血量中のCTCsの数がポアソン分布に従わず全身の総CTCsを反映しない場合がある事、薬事要件の整備が世界的に遅れており臨床現場での適用が標準化されていない事など、解決すべき問題はたくさん存在する。
バイオアソシエイツ株式会社 2014.07.01
