カナダのトロントにある病気の子供のための病院（SickKids）のフェノゲノミクスセンター科学技術開発部長の Lauryl Nutter博士（写真）を含む研究者らは、CRISPR酵素Cas9の使用を改善し、実験マウスの標的外変異誘発の可能性を減らすための新しい方法を見つけた。
研究者の遺伝子編集に関連する共通の懸念である精度を改善するための新戦略に役立つこの調査結果は、ヒューストンで開催された米国人類遺伝学会2019年次総会（ASHG2019）で2019年10月18日に発表された。
このプレゼンテーションは「全ゲノムシーケンスでCas9の標的外変異誘発を遺伝的浮動環境に入れる（Whole Genome Sequencing Puts Cas9 Off-Target Mutagenesis into the Context Of Genetic Drift.）」と題されている。
Nutter博士と複数機関のノックアウトマウスフェノタイピングプロジェクト（KOMP2）の共同研究者は、Cas9と遺伝子編集を定期的に使用して、特定の突然変異を持つ実験用マウスの系統を作り出している。 この研究では、マウス系統での標的外変異誘発の可能性（遺伝子編集プロセスによって導入された意図しない遺伝子変異）にしばしば遭遇する。
「我々は標的外変異誘発について、どの程度心配する必要があるのか知りたいと思っていた。」とNutter 博士は述べた。 マウスでの問題の程度を実証することにより、研究室で研究されているヒト細胞株でよりよく評価できるとともに、Cas9ベースの遺伝子編集の精度を改善する新しい方法を生み出したいと考えた。
これらの質問に答えるために、Nutter博士のチームは、Cas9とガイドRNAを使用してマウスの胚で58のゲノム編集実験を行い、異なる遺伝子に特定の標的変異を誘発し、それを子孫に伝えさせた。
合計175の異なるガイドRNAに対して、各実験に2〜4つのガイドを使用した。 その後、研究者は各マウスの全ゲノムの配列を決定し、結果として生じた可能性のある追加の変異を検索した。突然変異のベースライン率を得るために、Cas9処理マウス系統の全ゲノムを25匹の未処理対照マウスのゲノムと比較した。
Cas9処理マウス系統のうち31系統で、研究者は標的外変異誘発ゼロを発見し、残りの20系統では平均2.3標的外変異誘発を発見した。 それに比べて、処理されたマウス系統と未処理のマウス系統の両方で、各個体で平均3,500の自然に発生するユニークな突然変異を発見した。
「驚くべきことに、これらの結果は、自然発生する突然変異の数がCas9によって導入されたものをはるかに超えていることを示していた」とNutter 博士は述べた。 「また、ガイドRNAが適切に設計されている場合、標的外変異誘発は非常にまれであることも分かった。」
また、結果は、遺伝学研究における同系交配マウス系統の使用およびそれらを使用する際に研究者が行う仮定に環境を追加する。
「歴史的に、特定の定義された場所でのみゲノムが異なるため、マウスの遺伝学を研究するために同系交配マウス系統を使用した。マウス間の違いはそれらの違いによるものと想定していた。」 「しかし、同腹のマウスの間でも、自然に発生する数千の遺伝的差異が存在する可能性があることが分かった。」
「我々の結果は、Cas9や他のツールをゲノムで使用した場合、それは我々が考えるほど明確に定義されていないかもしれないことを認識する必要性を浮き彫りにた。」と彼女は述べた。
次のステップとして、Nutter博士と彼女の共同研究者は、DNA修復を阻害または強化する酵素が新しい突然変異の発生率に影響を与える可能性があるかどうかを調査する予定だ。 彼女らはまた、Cas9変異誘発の効率を改善することと、その精度を改善することとの間のトレードオフを調べることを計画している。 研究室のマウス系統の生産に焦点を当てて、研究者は、彼女らの発見が、Cas9が目的の標的に結合して目的の突然変異を誘発することを可能にする、より良いガイドRNAの開発に役立つことを願っている。
さらに広く言えば、研究者たちは、彼女らの発見がコントロールグループのより良い使用と、実験デザインに関するより多くの情報に基づいた視点につながることを望んでいる。 彼女らは、遺伝学に基づく治療の安全性と有効性の研究を含む、潜在的な治療的応用を伴う遺伝子編集研究において、この知識は特に重要であることを指摘している。
BioQuick News:Researchers Quantify Cas9-Caused Off-Target Mutagenesis in Mice; Thoughtful Design of Guide RNAs Can Significantly Limit Off-Target Mutagenesis; Inbred Lines Show Surprising Number of Natural Mutations
