質量分析イメージングについて-2

MSIでは平面状試料表面の微小領域からイオンを発生させるという特性上、用いられるイオン化法は限られます。有機分子を壊さずにそのままイオン化出来る、MSIで用いられるイオン化法として、MALDI (matrix laser desorption/ionization)とDESI (desorption electrospray ionization)があるという事を解説しました。

 今回は、それぞれについてもう少し詳しく解説します。両者ともMSIに用いられるようになったのは比較的最近ですが、その前からMSのイオン化法として用いられていました。世に登場してからMSIに用いられるようになった期間は、DESIの方がはるかに短いと思います。

・MALDI

　測定試料とイオン化促進剤としてのマトリックスを溶液の状態で混合し、金属製の板（ターゲットプレート）に滴下・乾燥させた後、パルスレーザーを照射すると、試料中の分子がイオンとなって脱離します。生成し易いイオンは、正イオン検出では[M+H]+や[M+Na]+、負イオン検出では[M-H]-などです。マトリックスは、通常試料に対して大過剰（例えばモル比で1,000倍～10,000倍）で混合するため、レーザー光はほぼ100%の確率でマトリックス分子に対して照射されます。代表的なマトリックスを図1に示しますが、レーザー光を吸収する性質をもっています。

マトリックス分子がレーザー光を吸収して励起され、試料分子と相互作用する事で試料分子がイオン化され固相から脱離します。レーザー光はレンズで集光出来るだめ、後述するDESIに比べて小さな領域からイオンを生成させる事が可能で（空間分解能が高い）、装置にも依りますが最高でsub-µmオーダーの空間分解能が得られます。

図1　MALDIで用いられる代表的なマトリックス

MALDIをMSIとして用いる場合のイメージを図2に示します。試料は通常凍結後薄切してスライドガラスに貼り付け、マトリックスを試料表面に塗布します。スライドガラスと、その近傍に配置されている引き込み電極に印加された電圧の差異によってイオンは質量分析計内部に送り込まれるため、スライドガラスに導電性が必要である。通常、ITO（Indium Tin Oxide）コートスライドガラスが用いられます。マトリックスの塗布は、MALDI-MSIには必須であり、マトリックスの選択は勿論、塗布する方法も結果を左右する重要な工程です。マトリックスを塗布する方法は大きく分けると、スプレー法と蒸着法の2種類があります。それぞれについ て、簡単に説明します。

図2 MSIにおけるMALDIのイメージ図

1. スプレー法

マトリックス溶液を様々な方法で液滴にして、試料表面に塗布します。液滴にする方法として、超音波による方法と、空圧ネブライザー方式があります。更に、空圧ネブライザー方式にも、装置を用いる方法とエアブラシなどを用いる手動の方法があります。ここでは、現在主として用いられている装置を使った空圧ネブライザー方式を取り上げます。筆者の主な所属先である浜松医科大学と同大学発ベンチャー株式会社プレッパーズでは、テクノアルファ株式会社で扱っているHTX Imaging社のTM-sprayer（https://www.technoalpha.co.jp/products/science/sprayer.html）を用いています。

マトリックス溶液を数十mg/mLの濃度（超純水／アセトニトリルなど）に調製し、装置のサンプルループに注入、付属の送液ポンプから溶媒を50 µL/min程度の流速で送液し、コンプレッサーから送られる圧縮空気でスプレーし、スライドガラス上の試料切片に吹き付けます。専用のソフトウエアによって、マトリックスを吹き付ける領域や吹き付け方（往復させる回数など）、スプレーノズルの温度などを設定します。

スプレーによって生成する微細な液滴は、試料表面に付着した瞬間にはまだ濡れているため、試料表面に存在する分子は液滴に抽出されてマトリックス分子と混合されます。図2に示す「中間層」がこれに相当します。ここで微細液滴のサイズは非常に小さいと、試料表面で液滴同士が凝集する事なく前述の抽出が起こり速やかに乾燥し、空間分解能の低下は最低限に抑えられます。2で解説する蒸着法の方が高い空間分解能が得られますが、スプレー法で高い空間分解能を得るためには、生成する微細液滴のサイズが重要であると考えられます。

筆者は超音波で液滴を生成させるタイプの装置も使用した事がありますが、液滴が試料表面に付着してから乾燥する迄の間に液滴同士が凝集してしまい、空間分解能が著しく低下した経験があります。超音波方式の装置が全て悪い訳ではないと思いますが、スプレー装置の性能が非常に重要である事が実感できました。

2. 蒸着法

蒸着法の装置は、筆者の視る限り（少なくとも国内では）株式会社島津製作所のみで開発・販売しています。浜松医科大学とプレッパーズでも、同社のiMLayer（https://www.an.shimadzu.co.jp/products/life-science-lab-instruments/imaging/imlayer/index.html）を使用しています。

真空中で粉末状のマトリックスを加熱して昇華させ、上部に試料面を下向きに配置したスライドガラス＆試料切片にマトリックスの結晶を蒸着させます。スプレー法より微細なマトリックス結晶ができるため、より高い空間分解能が得られやすいという特長があります。しかし、試料切片の表面をマトリックスが覆うような状態になり、スプレー法のように「試料成分が液滴の溶媒で抽出されてマトリックス分子と混合する」と言う状況は起こらないため、試料の種類や測定条件によってはスプレー法より検出感度が低くなることがあります。実際に筆者は、同じ試料（連続切片）を両者で測定して比較した時、分析種（ターゲット化合物）が、スプレー法では検出されたが蒸着法では検出されなかったという事象を経験した事があります。 

スプレー法と蒸着法、どちらも一長一短あるようなので、両者を組み合わせて使う場合もあります。どちらが優れているという事はなく、ケースバイケースで使い分けるものだと思います。どういう場合にどちらが良いというのは、きっちり区別するのは難しいと思います。１つ言える事としては、蒸着法の方が理論的に高い空間分解能が得られますので、高空間分解能が要求される分析に関しては、蒸着法が第一候補になってきます。

・DESI

DESIは、LC/MSで汎用されているエレクトロスプレーイオン化（ESI）と、基本的には同じ原理でイオンが生成します。水／メタノールなどの溶媒からエレクトロスプレーで生成した帯電液滴（一次帯電液滴）を試料切片の表面に照射し、液滴の溶媒によって試料表面の分子が抽出され、一次帯電液滴中の電荷（H⁺など）が試料表面の分子に移動して二次帯電液滴として脱離、イオン蒸発などによって生成したイオンはイオン取込チューブから質量分析計内部へと取り込まれます。DESIのイメージを図3に示します。

図3　DESIのイメージ図

DESIでは、スプレイヤーとイオン取込チューブの間に印加された電圧差によってイオンがチューブに取り込まれるため、MALDIの時の様な導電性スライドガラスは不要で、通常のスライドガラスを用いる事が出来ます。また、マトリックスの塗布も不要で、MALDIより前処理が簡便で分析に掛かるランニングコストを低く抑える事が出来ます。DESIのイオン化原理の基になるESIは、現存する多くのイオン化法の中で最もソフト（イオン化の際にターゲット分子に与えるエネルギーが低い）であり、不安定な分子を壊さずにイオン化できるという特長があります。しかし、一次帯電液滴は電荷反発が起こるため、試料表面における照射径はMALDIのレーザー径よりは大きくなってしまいます。即ち、空間分解能は MALDIよりは低くなるというデメリットがあります。

質量分析イメージング（MSI）を行う時、MALDIとDESIの装置の両方を使える環境にあってどちらを使うか考えるというのは、かなり贅沢な悩みと言えるでしょう。質量分析技術の中では、イメージングはまだ比較的新しく、MSIの分析を独自に行える機関は国内では少ないと思います。使える環境にある場合でも、多くはMALDIとDESIのどちらか一方で、稼働している装置としてはMALDIの方が圧倒的に多いと思います。MALDIの方が先にイメージングに使われ始めた事と、現在DESIはWatersの装置にのみ接続可能である事、がその理由でしょう。

DESIは、上記のようにソフトイオン化であるため、測定時に試料に与えるダメージが低いのが特徴の1つです。そのため、1つの試料で複数回の測定が可能です。例えば正イオン検出と負イオン検出を１つの試料に対して続けて行う、測定済みの試料を保存しておいて日を改めて再測定をする、DESIで測定した試料を再度MALDIで測定する、などが可能です。

MSIは新しい技術なので、余りご存じない方がまだまだ多いと思います。専用装置やソフトウエアが必要なのでハードルは高いと思います。私が所属している浜松医科大学と株式会社プレッパーズでは、様々な形式でMSIを試して頂くことが可能です。ご興味あればお気軽にご相談ください。