遺伝子編集技術が、また一つ大きな進化を遂げました。これまで主流だったCRISPR技術は、まるでハサミのようにDNAを「切る」ことで遺伝子を書き換えてきましたが、意図しない場所に傷をつけてしまうリスクも指摘されていました。もし、DNAを全く傷つけることなく、必要な遺伝子を狙った場所に正確に「貼り付ける」ことができたらどうでしょう？そんな夢のような技術が、今、現実のものとなりました。これは単なる改良ではなく、遺伝子治療の未来を根底から変えるかもしれない、「ゲノムを編集する」から「ゲノムをプログラミングする」へのパラダイムシフトの幕開けです。
単一タンパク質の遺伝子エディターがDNA切断なしで安全かつ部位特異的な治療用遺伝子の挿入を実現
2025年3月13日に『Nature Communications』誌で発表されたオープンアクセス研究が、ゲノム工学における重要な進歩を報告しています。この論文は、「Integration of Therapeutic Cargo into the Human Genome with Programmable Type V-K CAST（プログラム可能なV-K型CASTによるヒトゲノムへの治療用カーゴの組み込み）」と題され、Metagenomi社のジェイソン・リュウ氏（Jason Liu）らが、クリストファー・T・ブラウン博士（Christopher T. Brown, PhD）の監修のもとで執筆しました。本研究は、V-Kファミリーに属する、簡素化されたプログラム可能なCRISPR関連トランスポザーゼシステムを導入し、DNAの二本鎖切断を誘発することなく、治療用DNAをヒトゲノムへ正確に組み込むことを可能にします。
「切断」から「プログラミング」へのパラダイムシフト
従来のCRISPRゲノム編集は、DSBsを誘発し、その後のエラーを起こしやすい細胞修復プロセスに依存していました。これは、標的外の変異やゲノムの不安定性を引き起こす可能性があります。CASTプラットフォームは、切断を伴わない挿入ベースのアプローチを用いることで、そのような損傷を完全に回避します。これにより、特に治療応用において、より予測可能で潜在的により安全な遺伝子挿入が可能になります。
このV-K型CASTシステムは、標的を定めるためにRNA誘導型のCas12kタンパク質を一つしか必要としません。このミニマルな設計は、送達を簡素化し、複数のタンパク質を必要とする編集システムと比較して免疫応答のリスクを低減します。
分子メカニズム：DNAを切断しない組み込み
Cas9や他のヌクレアーゼとは異なり、V-K型CASTシステムにおけるCas12kは触媒的に不活性です。それは、合成RNAに導かれて標的配列を見つけるためのDNA結合足場として機能します。その後、Cas12kは追加のタンパク質、主にTnsC（DNAを配置するATPアーゼ）とTnsB（トランスポザーゼ）を動員し、これらが治療用DNAの挿入を仲介します。
末端逆方向反復配列に挟まれた挿入配列は、ガイドRNA結合部位から約60～70塩基対下流に組み込まれます。この方法ではDNAの切断が関与しないため、標的部位のゲノムの完全性が保たれます。
環境微生物からヒト細胞へ
このCASTシステムは、実験室では培養できないものの、環境シーケンシングを通じてDNAを分析できる未培養微生物のゲノムをメタゲノム解析する中で同定されました。研究チームは複数のV-K型システムを発見し、その中からMG64-1とMG64-6の2つをさらなる開発のために選択しました。
チームは、タンパク質工学（核局在シグナル（NLSs: nuclear localization signals）の付加や、Cas12kをsso7d、HMGN1、H1-coreなどのクロマチン結合ドメインと融合させること）を通じて、この細菌由来のシステムをヒト細胞内で活性を持つように適応させました。
部位特異的な治療用遺伝子の組み込み
重要な実証実験として、チームはこのCASTシステムを用いて、3.6キロベースの治療用第IX因子遺伝子を、安全で安定した遺伝子発現で知られるゲノム部位であるAAVS1セーフハーバーローカスに特異的に挿入しました。この部位への組み込みは、シーケンシングによって確認された通り、正確かつ完全でした。
・ヒト細胞での組み込み効率は1%を超過
・HEK293T、K562、Hep3b細胞株でテスト済み
・環状および線状の両方のドナーDNAで有効
・非増殖細胞でも活性があり、臨床的妥当性を拡大
これらの結果は、単一タンパク質のCRISPRトランスポザーゼシステムを用いたヒト細胞への完全長遺伝子挿入の初めての実証となります。
特異性とオフターゲットプロファイル
プラットフォームの安全性を評価するため、研究者らはゲノムワイドな挿入部位をマッピングしました。イベントの7%未満が標的外の位置で発生しました。これらのイベントは再現性が高く、限られたゲノム領域に集中しており、多くはガイドRNAの配列相同性とは無関係でした。
ほとんどの標的外挿入は、プラスミドの骨格部分やプロモーターが豊富な領域で発生しており、配列のミスマッチよりもクロマチンの構造やアクセスしやすさが非特異的な組み込みに影響を与えたことを示唆しています。
治療および合成生物学への応用
このコンパクトなV-K型CASTシステムは、以下をサポートします。
・二本鎖切断を伴わない、安全で標的化された遺伝子治療
・合成生物学的な回路のための多重ゲノム組み込み
・T細胞や幹細胞の改変を含む細胞工学プラットフォーム
・GMP準拠の製造に適した線状DNAを用いたスケーラブルな送達
その単一タンパク質構造と予測可能な組み込みプロファイルは、生体内（in vivo）および生体外（ex vivo）の両方のゲノム編集戦略において強力な候補となります。
限界と最適化戦略
その利点にもかかわらず、このシステムには限界もあります。
・環状ドナーを使用した場合、時折プラスミド骨格が共挿入される
・ClpXのようなヘルパータンパク質なしでは、低コピー数のゲノム座位での組み込み効率が低下する
・一部の組み込みイベントは依然として部分的にガイド非依存的であり、クロマチン決定因子のさらなる研究が必要
今後の取り組みは、ガイドRNA構造の改善、細菌の補因子への依存度の低減、そしてより広範な遺伝子座位における標的精度の向上に焦点が当てられるでしょう。
次世代のゲノム工学に向けて
本研究は、二本鎖切断を誘発することなく、治療用DNAの安全かつ効率的な部位特異的組み込みをヒト細胞で実証することにより、ゲノム編集の新しいモデルを確立しました。V-K型CASTシステムは、ゲノムを書き換えるための、プログラム可能でスケーラブル、かつ臨床的に妥当なアプローチを提供します。
この方法は、破壊による編集ではなく、意図的な遺伝子コンテンツを正確に導入するものであり、ゲノム編集からゲノムプログラミングへの移行を示すものです。
