新たな技術でGPCRの研究を加速—創薬研究の鍵となるRAMP解析

Science Advances誌に掲載された新しい研究は、215種類のGPCRとそれらが複合体を形成することが知られている3つのタンパク質間の相互作用をマッピングする新たなアプローチを紹介しています。この発見により、これらの相互作用およびその治療の可能性に関する理解が劇的に拡大しました。公開アクセス論文は「Multiplexed Mapping of the Interactome of GPCRs with Receptor Activity–Modifying Proteins（GPCRと受容体活性修飾タンパク質との相互作用網の多重マッピング）」と題されています。

「技術的には、前例のないスケールでこれらの受容体を研究できるようになりました」と、ロックフェラー大学の化学生物学およびシグナル伝達研究室の元大学院生であり、筆頭著者のイラナ・コトリアール博士（Ilana Kotliar, PhD）は述べています。
「生物学的には、これらのタンパク質-受容体相互作用の現象が当初考えられていたよりもはるかに広範囲にわたっていることが分かり、将来の研究の道を開くことになりました。」

未知の領域

この受容体ファミリーはGPCRs、つまりGタンパク質共役受容体として知られています。その補助タンパク質はRAMPs、受容体活性修飾タンパク質と呼ばれます。RAMPsはGPCRsを細胞表面に輸送するのを助け、受容体の形状を変えたり、位置に影響を与えたりすることで、そのシグナル伝達の方法を大きく変えることができます。GPCRsは孤立して存在することはほとんどないため、RAMPsの影響を考慮せずにGPCRを特定することは、レストランのメニューを見て、営業時間や住所、配達オプションを確認しないようなものです。

「同じ薬が同じ受容体を標的としているにもかかわらず、体内の2つの細胞のうち、ある細胞でしか効果を発揮しないということもあります」とリチャード・M・アンド・イザベル・P・フルラウド教授であるサクマー博士（Thomas P. Sakmar, MD）は述べています。「その違いは、ある細胞にはRAMPが存在してGPCRを表面に持ち上げ、薬がそれと相互作用できるようになっていることです。これがRAMPsの重要性です。」
この事実を認識したサクマー博士らのチームは、各RAMPが各GPCRに与える影響を分析できる技術の開発に取り組むことを決意しました。GPCR-RAMP相互作用の包括的なマップは、創薬を大幅に加速させる可能性を持ち、特に有望だったGPCR薬がなぜ効果を示さなかったのかを説明できるかもしれません。

科学者らは、このようなマップがいくつかの「孤児」GPCRがどのような自然リガンドと相互作用するのかを明らかにすることで、基礎生物学の発展にも貢献すると期待しました。「私たちはまだ多くのGPCRが体内でどのように活性化されるのかを知りません」とコトリアール博士は述べています。「これまでのスクリーニングはGPCR-RAMP複合体を探していなかったため、それらの組み合わせを見逃していた可能性があります。」
しかし、すべてのGPCR-RAMP相互作用を探る作業は非常に困難でした。既知のRAMPは3種類、GPCRは約800種類あるため、すべての組み合わせを探索するのは現実的ではなく、事実上不可能でした。2017年、サクマー博士の研究室の当時の大学院生であるエミリー・ロレンゼン博士（Emily Lorenzen, PhD）は、スウェーデンのライフサイエンス研究所およびスウェーデンのヒューマンプロテインアトラスプロジェクトの科学者らと協力し、GPCR-RAMP相互作用をスクリーニングするアッセイの開発を開始しました。

数百の実験を一度に

チームはヒューマンプロテインアトラスの抗体を磁気ビーズに結合させるところから始めました。それぞれのビーズには500種類の異なる染料の1つで色付けされていました。これらのビーズを、RAMPとGPCRのさまざまな組み合わせを発現するように設計された細胞の液体混合物と一緒にインキュベートしました。このセットアップにより、研究者は単一の実験で何百ものGPCR-RAMP相互作用の可能性を同時にスクリーニングすることができました。各ビーズが検出装置を通過すると、色分けによりどのGPCRがどのRAMPに結合しているかを特定し、高スループットで215種類のGPCRと既知の3つのRAMPとの相互作用を追跡できるようになりました。
「この技術の多くは既に存在していました。我々の貢献は、それに基づいて構築されたエンブレム技術です」とサクマー博士は述べています。「私たちは一度に数百の異なる複合体をテストする技術を開発しました。これにより大量のデータが生成され、多くの質問に同時に答えることができました。」

「ほとんどの人は複数同時実験を考えません。しかし、私たちはそれを実行しました――500の実験を同時に行いました。」
この研究は長期間にわたるチームの努力の結晶ですが、コトリアール博士は特に大きな貢献をしました。COVID中の限られた渡航期間を利用して、スウェーデンとの間でサンプルや貴重な試薬を頻繁に往復させ、研究を成し遂げました。
努力は報われました。結果として、GPCR研究者や創薬開発者にとって待望のリソースがいくつか提供されることになりました。これには、抗GPCR抗体の公開オンラインライブラリー、エンジニアリングされたGPCR遺伝子、そしてもちろん、マッピングされた相互作用も含まれます。「今では、好きな受容体を入力するだけで、それに結合する抗体が何か、商業的に入手可能かどうか、またその受容体がRAMPに結合するかどうかを確認できます」とサクマー博士は述べています。

この発見により、実験的に特定されたGPCR-RAMP相互作用の数が一桁増加し、GPCRの組み合わせを検出し、有害な自己抗体を特定する手法の基礎を築くことができました。「最終的には、これは技術指向のプロジェクトです」とサクマー博士は述べています。「我々の研究室が行っていることは、創薬を進展させる技術の開発です。」

論文の概要

Science Advances誌の論文概要では、著者らは次のようにその研究を概説しています：
「受容体活性修飾タンパク質（RAMPs）は、Gタンパク質共役受容体（GPCRs）と複合体を形成し、細胞内輸送および薬理学を調節する可能性があります。RAMPとの相互作用は約50種類のGPCRにおいて確認されていますが、詳細に研究されたGPCR-RAMP複合体はごく一部に限られています。包括的なGPCR-RAMP相互作用網を明らかにするため、我々はGPCRの全サブファミリーを代表する215の二重エピトープタグ付き（DuET）GPCRライブラリーを作成し、各GPCRを3つのRAMPのいずれかと共発現させました。カスタマイズされた多重懸濁ビーズアレイ（SBA）イムノアッセイを用いてGPCR-RAMPペアをスクリーニングし、少なくとも1つのRAMPとの強い相互作用を示す122のGPCRを特定しました。3つの細胞系で相互作用をスクリーニングし、RAMPと複合体を形成する23の内因性発現GPCRを発見しました。GPCR-RAMP相互作用網のマッピングは、RAMPと相互作用するGPCRの系統的機能特性を拡張し、GPCR-RAMP複合体を標的とする選択的治療薬の設計に役立ちます。」

写真：イラナ・コトリアール博士（Ilana Kotliar, PhD）

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